干细胞源性细胞外囊泡在修复椎间盘退变中的研究进展

黄子宇 赵必增

腰背痛是临床常见的一类肌肉骨骼症状，该症状与椎间盘退变（IDD）密切相关[1]。椎间盘是位于椎体之间的复杂结构，包括髓核、纤维环和软骨终板，这种独特的结构使脊柱具有弯曲能力和减震性能。随着IDD 的进展，髓核和纤维环的抗压结构和抗压能力发生退变。当前针对IDD 的常见疗法有手术治疗和保守治疗，手术治疗主要包括髓核摘除和椎间融合术，但都只能缓解IDD临床症状却无法干预IDD 的进程，寻找更为有效的延缓甚至逆转IDD 进程的治疗方案是有潜力的研究方向。随着干细胞研究不断的深入，从细胞上清液中分离获取的干细胞源性细胞外囊泡已成为干细胞潜在的替代品。许多研究发现，干细胞源性细胞外囊泡可促进血管再生，减轻炎症反应，抑制凋亡。因此，干细胞源性细胞外囊泡在延缓IDD 方面也受到了越来越多的关注。本文就干细胞源性细胞外囊泡在IDD 中的研究进展和应用前景进行综述。

1 IDD 病理机制及治疗

1.1 IDD 病理机制

椎间盘由髓核和纤维环组成，是脊柱的承重和缓冲单元。髓核细胞位于内盘，主要产生细胞外基质及维持其平衡。当机体发生IDD 变时，髓核中蛋白多糖含量减少，髓核胶样物质脱水，导致髓核和纤维环的抗压结构异变和抗压能力下降[2]。研究认为，IDD 进展包括髓核细胞消耗和细胞外基质降解，软骨终板对纤维环内层和髓核细胞营养供应减少[3-4]。

1.2 IDD 当前的治疗

目前临床上IDD 常规治疗方法有保守治疗和手术治疗，如果保守治疗不能缓解疼痛且达到手术指征，可以考虑手术。然而，脊柱融合术、椎间盘摘除术等外科手术是侵入性的，通常需要较长的术后恢复时间且可能出现手术并发症，术后复发率也较高[5]。药物治疗和手术治疗只能缓解腰疼症状，未能从根本上延缓IDD 的进程。因此，许多研究集中于促进椎间盘再生，治疗方法包括生长因子疗法、基因疗法和干细胞疗法。

生长因子疗法是将生长因子直接注射到椎间盘中，从而促进细胞外基质合成，或延缓抑制炎症反应变性。目前常应用的生长因子有骨形态发生蛋白（BMP）和转化生成因子（TGF）-[6]。生长因子疗法的主要局限性是生物半衰期短，只有数小时或数天，且生长因子在恶劣的退变椎间盘微环境中很难维持活力，这些都限制了生长因子在IDD 治疗中的应用。

基因疗法则是通过载体将修复基因转染至椎间盘内的髓核、终板、纤维环细胞中，或将细胞取出，改变其特定的基因，再重新植入椎间盘内。一旦基因成功转染到靶细胞上，延缓IDD 的效果将长期存在。然而，基因治疗涉及遗传物质主动转移，通常使用病毒载体，存在发生病毒突变、全身病毒感染、免疫反应等病毒相关并发症的风险。

干细胞疗法是将各种干细胞注射到退化的椎间盘中，通过移植干细胞增殖、分化来调控和平衡椎间盘内环境，促进椎间盘再生。目前用于治疗IDD 的干细胞有脂肪源性干细胞（ADSC）、骨髓间充质干细胞（BMSC）、髓核间充质干细胞、脐带间充质干细胞及肌肉源性干细胞等[7-8]。BMSC即使在不利条件下也能够保持显著的高生存能力，是目前用于IDD 干细胞疗法中最常用的干细胞[9]。研究显示，BMSC 可抑制细胞凋亡水平，从而改善椎间盘变性[10]。Zhou 等[11]将BMSC、ADSC 和纤维环细胞进行共培养处理，结果表明Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖在BMSC、ADSC 中均表达上调，且可分化为纤维环样细胞，但BMSC 修复纤维环的效果优于ADSC。然而，随着IDD 的发展，椎间盘中所含的干细胞数量和迁移能力都因退化椎间盘微环境恶化而下降[12]。此外，椎间盘微环境与干细胞所需的生长环境有很大不同[13]，导致移植细胞在退化椎间盘恶劣微环境中缺乏完全的再生反应，难以生存，酸性pH[6]和高渗[14]会严重损害细胞活力和表型。

越来越多的研究表明，干细胞延缓IDD 进展的功能大部分是通过旁分泌途径实现[8]，而干细胞源性细胞外囊泡是旁分泌途径的重要组成部分，它们是源自于供体干细胞释放的由脂质双分子层构成的纳米颗粒，其中含有多种生物活性物质（包括蛋白质、脂质、DNA、RNA 等）[15]。干细胞源性细胞外囊泡在髓核再生和椎间盘微环境稳态维持中具有重要作用[16]，如抑制髓核细胞凋亡、热解、异常神经侵袭，促进血管生成、细胞外基质合成及髓核细胞增殖和自噬，减轻炎症反应，从而抑制或延缓IDD。

2 干细胞源性细胞外囊泡治疗IDD

2.1 细胞外囊泡特性与功能

细胞外囊泡包括小细胞外囊泡和微囊泡等。小细胞外囊泡是作为细胞之间通讯的关键信使，包含多种功能蛋白、miRNA、mRNA 及信号脂质等[17]。小细胞外囊泡直径一般为30～150 nm，且具有性质稳定、易获取、易保存、易转化、无免疫原性等特点。

脂质、蛋白质与核酸是细胞外囊泡的主要功能成分。脂质主要位于囊泡膜上，包括胆固醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂等。除了维持小细胞外囊泡的生物稳定性外，脂质还参与了小细胞外囊泡的形成和释放等生物过程[18]。小细胞外囊泡还富含各种蛋白质，包括细胞骨架成分、四环素、热休克蛋白及其他类型的蛋白质[19]。其中，Alix 和Tetraspanin 蛋白如CD81、CD9 和CD63 是小细胞外囊泡的标记[20]。小细胞外囊泡可通过与细胞膜融合，将其携带的功能核酸、脂质、蛋白质等传递到受体细胞，进而引起受体细胞功能、活性改变，促使细胞间的物质交换与信息交流[21-22]。鉴于小细胞外囊泡的功能与优势，注射携带有特定基因及治疗药物的小细胞外囊泡可能成为延缓IDD 的治疗手段[23]。

2.2 干细胞源性细胞外囊泡延缓IDD 的机制

2.2.1 促进基质合成

Xiang 等[24]将源自人尿源性干细胞来源的小细胞外囊泡与退变的髓核细胞进行共培养处理，结果表明随着共培养时间延长，细胞增殖显著增加；细胞外基质中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达水平与共培养时间呈正相关，而与退变相关的基质金属蛋白酶（MMP）表达水平与培养时间呈负相关，提示BMSC 衍生的小细胞外囊泡可起到促进髓核细胞增殖、维持细胞外基质平衡的作用。

Zhang 等[25]研究证实，经含miR-15a 的小细胞外囊泡处理的髓核间充质干细胞可上调蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA 和蛋白水平，同时下调血小板反应蛋白解整合素金属肽酶（ADAMTS）4/5、MMP-3/13 mRNA 和蛋白水平，通过磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和Wnt3a/ -连环蛋白轴下调MMP-3 促进髓核间充质干细胞软骨分化。

退行性椎间盘组织中的自噬功能障碍是细胞死亡的主要原因，而自噬是调节椎间盘细胞间基质代谢的重要途径[26]。研究证实，自噬激活可以促进髓核细胞衍生的细胞外囊泡释放，从而防止髓核细胞基质降解；自噬激活可通过携带miR-27a的小细胞外囊泡延缓IDD 进程，其在白细胞介素（IL）-1 刺激下可抑制MMP-13 表达[27]。

2.2.2 减轻细胞凋亡反应

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