适配体功能化分子印迹聚合物的研究进展

褚 希,叶 泰,袁 敏,曹 慧,郝丽玲,吴秀秀,阴凤琴,于劲松,徐 斐

(上海理工大学 健康科学与工程学院,上海食品快速检测工程技术研究中心,上海 200093)

分子印迹技术自1931年首次被提出至今,作为合成具有选择性识别能力的聚合物的重要手段之一,已被广泛应用于金属离子、小分子化合物、核酸和蛋白的分离、富集和传感[1-3]。制备得到的分子印迹聚合物(MIP)具有特定的分子识别结合位点、良好的机械强度以及环境稳定性等特性[4]。在MIP的制备过程中,模板分子通常预先与功能单体组装,在引发剂和交联剂的共同作用下形成内嵌模板分子的聚合物网络,除去模板分子后,得到具有识别结合能力的三维印迹空腔[5-8]。合适的功能单体是提高MIP选择性和亲和力的基础,功能单体(如丙烯酰胺[9]、氨基硅烷[10]、甲基丙烯酸[11]等)与模板分子通过共价键或非共价键形成特定的识别位点,然而这种识别机制的应用面临许多局限。近年来,为了提高MIP 对目标分子的结合能力,研究者们以抗体[12]和肽链[13-14]作为功能单体聚合到印迹空腔中。与传统小分子功能单体相比,尽管采用这种大分子功能单体制备得到的MIP 具有更优的亲和力和更好的选择性,但是存在制备成本高、化学稳定性差等问题。

适配体(Apt)是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术进行体外筛选得到的具有特异性靶标识别能力的寡核苷酸链[15]。近年来,越来越多的研究者以Apt作为大分子功能单体制备适配体功能化分子印迹聚合物(Apt-MIP),其不仅可以通过构筑多个识别位点提高印迹空腔对模板分子的结合能力,同时制备过程中所形成的聚合物印迹层能够有效稳定Apt与模板分子的结合构象,提高Apt的亲和力[16]。在与靶标的识别结合过程中,Apt通过π-π堆积、静电相互作用、范德华力以及氢键等自适应地折叠成具有特定识别能力的空间构象,从而实现对靶标的特异性识别[17-18]。与抗体相比,Apt易于化学合成与修饰,有利于将其与靶标的识别结合定量地转化为光、电等信号输出[19-20],为MIP 识别结合模板分子过程中的信号转换提供了新的思路[21]。本工作介绍了Apt-MIP 的制备方法,并对其在生物传感器以及分离与富集方面的应用进行了综述和展望。

1 Apt-MIP的制备

将Apt嵌入印迹空腔是制备Apt-MIP的关键,目前常见的印迹策略主要有自由基聚合和电聚合两类[22-23]。

1.1 自由基聚合

自由基聚合是通过光、热等引发乙烯基等功能单体聚合,是对聚合物链拓扑结构和功能调控的重要手段之一,被广泛用于MIP 的制备。2013 年,SPIVAK 课题组[24]首次采用末端修饰丙烯基的Apt和丙烯酰胺作为功能单体,通过自由基聚合制备了凝血酶和血小板衍生生长因子的分子印迹凝胶,该凝胶对模板蛋白表现出良好的溶胀响应,其亲和力较无Apt的提高了4.5～5.0倍。在此基础上,SPIVAK 课题组[25]将Apt功能化分子印迹凝胶与光栅衍射传感器耦合,利用激光传输装置将凝胶体积变化转化为光衍射信号用于苹果茎痘病毒检测,检出限低至10μg·L-1,弥补了蛋白等大分子物质在凝胶中扩散速率较慢的缺陷。在分子印迹凝胶的制备过程中,Apt中烯烃基团修饰的位置和数量可能破坏Apt与靶标的结合构象,进而影响分子印迹凝胶的识别性能。POMA 等[26]在可卡因Apt中引入烯烃改性的2′-脱氧尿苷残基,使Apt和聚合物层之间形成单个或多个共价锚定位点,所制备的Apt功能化分子印迹凝胶的亲和力是无Apt的6.6倍。然而,仅在靠近可卡因Apt 3′端处引入单个烯烃修饰的分子印迹凝胶则几乎失去了对可卡因的结合能力。与修饰未剪裁的Apt相比,采用短链Apt片段作为功能单体,其稳定性更好、成本更低。ZHANG等[27]以丙烯基修饰的分裂型三磷酸腺苷Apt片段作为功能单体制备分子印迹凝胶,其亲和力比无Apt的高15倍。并且,与游离的分裂型Apt片段相比,印迹后其亲和力增加了一倍。为了获得性能优异的分子印迹凝胶,除了改变Apt的修饰策略外,合适的共聚单体有利于提高其选择性识别的能力。LI等[28]针对腺苷Apt识别过程易受脱氧腺苷干扰的问题,在聚合过程中引入丙烯酰胺基苯硼酸作为共聚单体,制备了Apt功能化分子印迹凝胶,利用硼酸基团与腺苷分子中顺式二醇间的共价作用,实现了对腺苷的高选择性识别。将多个Apt聚集在印迹位点形成多价效应[29],能够有效提高Apt与分子印迹凝胶的协同识别。

1.2 电聚合

电聚合是在一定电势或电流的作用下在电极表面引发聚合的过程,其中导电聚合物层在模板分子存在的情况下涂覆在电极或支撑基板材料上。与自由基聚合相比,电聚合具有制备快速、印迹层厚度和形貌可控以及制备的聚合物在传感器表面黏附性好等特点,因此被广泛应用于分子印迹修饰电极生物传感器的制备[30]。JOLLY 等[31]将末端巯基修饰的前列腺特异抗原Apt固定到金电极表面,通过控制聚多巴胺沉积到前列腺特异抗原Apt复合物的周围,洗脱蛋白模板后得到Apt功能化的聚多巴胺印迹层。与Apt修饰电极相比,制备的Apt-MIP修饰电极对前列腺特异抗原的灵敏度更高,检出限低至1 ng·L-1。然而,对比聚多巴胺沉积前后Apt的选择性发现,印迹后Apt的选择性系数较游离Apt低了5倍[32-33]。这种电聚合印迹层造成的Apt选择性降低,可能是由于电活性单体聚合过程中产生了大量非特异性结合位点。另一方面,电聚合单体不仅用于构筑聚合物层,同时还决定了印迹空腔中除Apt 外的结合位点的性质。ROUSHANI等[34]利用间苯二酚中的-OH 与氯霉素分子中的-NO2、-OH、-NH 等基团形成氢键,进一步增强了印迹空腔的识别能力。ROUSHANI等[35]选择邻苯二胺和邻二羟基苯作为双功能单体,使得聚合物层中分布-NH 和-OH 等多种结合位点,提高了对靶标的结合效率,所构筑的Apt-MIP修饰电极对毒死蜱的结合响应平衡时间仅为9 min。此外,MOKHTARI等[36]选择电活性物质亚甲基蓝作为聚合单体,制备了兼具优异导电性和稳定性的肌钙蛋白Apt-MIP,其修饰电极对模板分子的检出限低至1.04 pmol·L-1。

2 生物传感器

2.1 电化学传感器

电化学分析方法因具有灵敏度高、响应快速以及操作简便等优势而被广泛关注,在电极表面修饰MIP[37-39]或Apt[40-42]来制备电化学传感器,能够实现对靶标的选择性识别。然而,样品中非电活性物质吸附到电极表面所导致的电极污染问题,严重阻碍了分析物与电极表面的接触,降低了电化学传感器的检测灵敏度[43]。在电极表面修饰Apt-MIP 能够减少非特异性吸附,同时可提高电极界面Apt对靶标的亲和力。RAD 等[44]将巯基修饰的四环素(TET)Apt固定在纳米金沉积的电极表面,通过电聚合将多巴胺包覆在Apt周围,制备的修饰电极对TET 检出限低至144 fmol·L-1。基于相似的策略,SHAHDOST-FARD 等[45]将

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